Luigi Rigano, Chiara Andolfatto
Rigano Industrial Consulting and Research
via Bruschetti, 1 – 20125 Milano (Italy)
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Andrea Maltagliati
Personal Care Sales Manager & BDMPrincipium S.A.
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Riassunto
L’estratto del fiore di Loglio, Pangenine Lolium (INCI Lolium perenne flower extract), è un nuovo principio attivo anti-invecchiamento contenente vitamine, oligoelementi e aminoacidi; è un complesso di principi attivi essenziali per l’avvio dei processi energetici cellulari.
I componenti di questo estratto forniscono energia al metabolismo delle cellule della pelle, arricchiscono il derma di aminoacidi essenziali e proteggono la struttura della cute contro le quotidiane aggressioni esterne quali inquinamento, agenti ossidanti e fattori infiammatori cronici.
I risultati dei test in vitro e in vivo dimostrano una serie di proprietà benefiche per la pelle e portano ad una riduzione dei segni visibili del progressivo invecchiamento della cute. Questo estratto (Pangenine lolium) solubile nella fase acquosa, privo di solventi, senza conservanti e anallergico, è ottenuto attraverso un particolare ed innovativo procedimento certificato. Dimostra ottima compatibilità con la maggior parte degli ingredienti cosmetici e ha un leggero odore floreale.

Introduzione
L’invecchiamento è un processo progressivo dovuto a molte variabili e influenzato da diversi fattori tra cui stile di vita, status sociale, esposizione ambientale e fattori fisiologici quali genetica, cambiamenti ormonali e processi metabolici. Nonostante il processo di invecchiamento coinvolga tutti gli organi del corpo, esso si manifesta più visibilmente sulla cute. La pelle è il primo “organo di comunicazione” tra gli individui: mantenere un aspetto giovane e salutare, prevenendo i danni evidenti dell’invecchiamento, è requisito fondamentale per un buon rapporto con noi stessi e gli altri .
Tutte le strutture della pelle, le funzioni e l’aspetto sono compromessi dallo scorrere del tempo. Lo stress ossidativo è considerato di primaria importanza nel processo di invecchiamento. Esistono prove concrete per sostenere che l’invecchiamento sia associato alle conseguenze dei danni provocati dai radicali liberi indotti da diverse specie reattive con l’ossigeno (ROS – reactive oxygen species). I ROS includono il superossido, i radicali idrossilici e altre forme attive dell’ossigeno, come il perossido di idrogeno e l’ossigeno medesimo. L’invecchiamento è associato a cambiamenti nella struttura molecolare del DNA, delle proteine, dei lipidi e delle prostaglandine (tutti segnali di stress ossidativo). L’accumulo di queste modifiche molecolari costituisce la base dell’invecchiamento cellulare. Anche se la pelle possiede attività anti-ossidanti estremamente efficienti, durante l’invecchiamento i livelli di ROS aumentano ed i sistemi anti-ossidanti endogeni iniziano a decadere. Inoltre, altri scenari concorrono a complicare il quadro generale, compresi gli errori spontanei che avvengono nelle cellule riproduttive, le modifiche delle proteine ecc (1).
Lo spessore del derma diminuisce con l’età e questa evoluzione è accompagnata da una diminuzione del numero di mastociti e fibroblasti, e da una riduzione della produzione di collagene, elastina, glicosaminoglicani e acido ialuronico.
I ridotti livelli di collagene ed elastina, e la loro organizzazione alterata si verificano principalmente a causa della diminuzione della sintesi proteica, che colpisce il collagene I e III, con il contemporaneo tasso di decomposizione più elevato delle proteine nella matrice extracellulare. Il deterioramento delle proteine nel derma contribuisce allo sviluppo di rughe e perdita di elasticità (2).
Come l’età, anche il sistema immunitario subisce profondi cambiamenti, la cosidetta immuno-senescenza. Queste modifiche comprendono l’aumento graduale di produzione e circolazione dei mediatori di infiammazione, portando ad un stato cronico di infiammazione sistemico, di basso grado, controllato e asintomatico. Questo fenomeno è denominato Inflamm-aging, una combinazione tra infiammazione e invecchiamento (3,4).
Le forze potenziali che guidano l’inflammaging sono le citochine pro-infiammatorie e le sostanze elencate nella Tabella 1 (5).

Il modello micro-infiammatorio che caratterizza l’inflammaging costituisce una risposta molto complessa di vari fattori interni ed ambientali (6). L’esposizione della pelle alle radiazioni UV, per esempio, è nota per aumentare i livelli di citochine pro-infiammatorie (7). L’inflammaging genera ROS, causando danni ossidativi e inducendo l’amplificato rilascio di citochine, perpetuando così un circolo vizioso: l’invecchiamento, conseguentemente, è così corredato da un basso grado di cronicità e da una sistemica sovra-regolazione della risposta infiammatoria (4) .
Con l’avanzare dell’età, anche l’attività del “sistema respiratorio” mitocondriale e dei suoi enzimi costitutivi diminuiscono, riflettendosi in un declino nella sintesi di energia (ATP). Nelle cellule dei mammiferi, i mitocondri sono organelli che generano la maggior parte di energia sotto forma di ATP attraverso la catena respiratoria e il sistema di fosforilazione ossidativa. Questo è un modo molto sofisticato ed efficiente di generare ATP dai nutrienti di cui gli esseri umani si forniscono attraverso l’alimentazione. Per questo motivo, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nel processo di invecchiamento (8). Infatti, il declino delle funzioni mitocondriali potrebbe aumentare la produzione di ROS e stimolare processi di inflammaging (9).

Contrastare l’invecchiamento attraverso attivi cosmetici
Se si tiene conto dei fenomeni sopra descritti, è abbastanza evidente che alcuni prodotti per uso topico potrebbero funzionare contro alcuni processi biochimici e verso alcune cause che sono coinvolte nel processo di invecchiamento. Dai semplici idratanti, che mantengono l’equilibrio dell’acqua nella pelle, ai filtri UV per evitare fenomeni di invecchiamento dovuto all’esposizione solare, ad antiossidanti e anti-radicali liberi per sostenere la proliferazione cellulare: un intero esercito di ingredienti è stato assemblato per contrastare gli effetti del tempo sulle proprietà della pelle e sul suo aspetto. Poiché i fenomeni di invecchiamento della pelle sono abbastanza complessi, uno strumento preferenziale per questa lotta è rappresentato dagli estratti vegetali. Prima di tutto, perché sono ricchi di una serie di ingredienti benefici, con una ampia gamma di effetti funzionali: dai polisaccaridi alle proteine complesse, dagli agenti di assimilazione ai protettori degli enzimi, dai minerali alle vitamine. Il mondo vegetale è ancora in gran parte inesplorato, e ogni nuova indagine risulta essere una scoperta interessante per nuovi tipi di efficacia cosmetica.

Pangenine lolium: efficacia naturale 4-in-1
Per contrastare il più possibile gli effetti ed i segni dell’invecchiamento, alcuni ingredienti vegetali, sostenibili ed eco-compatibili sono stati recentemente resi disponibili per applicazione topica. Un nuovo estratto*, con dimostrata attività anti-aging, è ottenuto dalla estrazione senza solventi dei fiori di Loglio. La strategia per preparare questa materia prima parte dalla scelta della fonte vegetale: il Loglio (Lolium perenne) è un ingrediente base ben noto nella nutrizione umana e la sua farina è apprezzata nell’industria alimentare oltre ad avere benefici per la salute. La specie selezionata è ottenuta da coltivazioni specifiche, in condizioni climatiche particolari presenti nel Middle East degli Stati Uniti d’America. La produzione dell’estratto inizia dal rigoroso controllo delle coltivazioni, che sono prive di pesticidi e agenti chimici, e continua con raccolta, selezione, essiccazione, estrazione per concludersi con controllo, confezionamento e stoccaggio. Il tratto distintivo del processo di estrazione senza solvente è assolutamente innovativo. Esso consiste nella formazione di un micro-foro nella porzione esterna dei granuli contenuti nei fiori.
In seguito la parte interna dei granuli, costituita dai composti attivi di interesse cosmetico, viene “spremuta” e sottoposta a filtrazione, pressione, concentrazione, centrifugazione/purificazione ed evaporazione/standardizzazione. Il materiale risultante è un estratto (senza l’uso di solventi) anallergico, ottenuto da materie prime standardizzate (Fig.1). E’ ricco di vitamine, oligoelementi ed aminoacidi, un concentrato di principi attivi essenziali per i processi energetici delle cellule della cute (10). In questo studio è stata approfondita la possibilità di fornire alle cellule della pelle i mattoni fisiologici, ri-energizzandoli e rendendo l’aspetto della pelle più giovane.

Scopo dello Studio
Sono state effettuate prove in vitro e in vivo per indagare il potere anti-invecchiamento dell’estratto di Lolium perenne (11-14).
In particolare, le valutazioni in vitro sono state finalizzate a verificare la capacità del prodotto testato di aumentare la sintesi proteica, di modulare le cause infiammatorie e di attivare il metabolismo mitocondriale nei fibroblasti umani, quando esposti al trattamento con Lolium perenne flower extract.
Lo scopo della successiva valutazione in vivo mira a confermare l’efficacia anti-invecchiamento dell’estratto di Lolium perenne quando formulato in una crema per la cura della pelle applicata su volontari umani.

Materiali e Metodi
Risultati sulla sintesi proteica
La capacità dell’estratto di Lolium perenne di aumentare la sintesi proteica in fibroblasti umani è stata misurata mediante test colorimetrici. I fibroblasti (ATCC-CRL-2703) sono stati esposti a soluzioni di Pangenine Lolium a 3 diverse concentrazioni: 0,3% – 0,5% e 1,0 %. L’esposizione delle cellule è stata prorogata per 8 e 24 ore. Alla fine di ogni periodo sperimentale, mediante il saggio di Lowry, è stata determinata la neo-sintesi proteica delle cellule.
I risultati sono espressi come % di aumento della sintesi proteica (media di due ripetizioni) rispetto ad una coltura di cellule di controllo.

Effetto anti-ossidante e modulazione dei mediatori infiammatori
L’invecchiamento cellulare è stato indotto artificialmente mediante un’esposizione ripetuta ai raggi UV (UVA + UVB 48 mJ/cm2) di fibroblasti cutanei umani (ATCC-CRL-2703) e monitorato per mezzo di un indicatore di invecchiamento (LPO, lipoperossidazione). La valutazione di alcuni mediatori infiammatori rilasciati durante il trattamento è stata effettuata e confrontata rispetto a a) cellule non trattate e non esposte (CTR-, espressione del valore basale per ciascuna citochina considerata) e b) cellule non trattate ed esposte (CTR+, espressione dell’alterazione delle citochine indotta dall’invecchiamento). I mediatori infiammatori considerati in questo test sono stati IL1α , IL1β , IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, GM- CSF, IFNγ e TNFα. Pangenine Lolium è stato testato allo 0,3% e 0,5%. L’esposizione delle cellule a campioni di prodotto e alla luce UV è stata eseguita secondo il modello descritto nella Tabella 2. Lo studio di invecchiamento cellulare (tramite LPO) è stato effettuato mediante un saggio basato sulla capacità di un cromogeno, N-metil-2-fenilindolo (NMPI), di reagire con Malonyldialdehyde (MDA) a 45°C e pH acido, per produrre un cromoforo stabile. Questo ha un picco di assorbimento a 586 nm. MDA è uno dei principali prodotti di perossidazione lipidica. La concentrazione MDA in un sistema biologico è da considerarsi un buon indice del danno lipo-perossidico. I risultati sono espressi come variazione % dei livelli di lipoperossidazione (MDA) rispetto ad una coltura di cellule di controllo non trattate. Quantibody® è lo strumento utilizzato per eseguire il metodo d’analisi immunologico (sandwich) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) utilizzato per misurare la concentrazione dei mediatori infiammatori. I risultati sono espressi come variazione % del rilascio di mediatori nella coltura rispetto alle cellule non trattate e non esposte.

Attivazione di mitocondri
Le proprietà di attivazione e di rinforzo del metabolismo mitocondriale da parte del prodotto sono stata determinate mediante la valutazione del potenziale di membrana mitocondriale con JC1, un colorante fluorescente stabile avente alta affinità con i mitocondri. Il saggio preliminare MTT è stato effettuato per misurare la % di vitalità cellulare. Quindi, la prova è stata effettuata in versione triplicata utilizzando colture di fibroblasti (ATCC-CRL-2703) trattate per 8 e 24 ore con 0,3%, 0,5% e 1,0% di Pangenine Lolium rispetto a colture cellulari senza alcun trattamento (CTR). Ad ogni tempo sperimentale, le cellule sono state raccolte, centrifugate e risospese in un terreno di coltura con JC1 (1mg/ml). Dopo 15’ di incubazione a 37°C, i campioni sono stati misurati con cito-fluorimetro Pas III dotato di filtro per lettura JC1. I risultati sono espressi come quantità di cellule con mitocondri attivi e percentuale di aumento ad ogni condizione sperimentale monitorata.

Efficacia anti-aging in vivo
In seguito ai risultati delle prove in vitro sopra descritte, è stata valutata l’efficacia cosmetica anti-invecchiamento attraverso l’impiego di una formulazione contenente Lolium perenne.
Su un campione selezionato di 20 volontari di sesso femminile (età media 53 anni) sono stati applicati 2 prodotti su ciascun lato del viso due volte al giorno per 4 settimane: un prodotto contenente 0,5% di Pangenine Lolium (campione attivo, Tabella 3) e lo stesso prodotto senza estratto di Lolium perenne (campione placebo).
All’inizio del test (T0), dopo 15 giorni (T15), e alla fine, dopo 30 giorni (T30) sono state effettuate valutazioni strumentali di rugosità della pelle (da dispositivo Primos 3D, GFMesstechnik GmbH), lipo-perossidi e capacità antiossidante totale. Tutti i dati sono stati analizzati statisticamente.
Le valutazioni cliniche sono state eseguite dal dermatologo secondo i punteggi clinici riportati in Tabella 4, all’inizio (T0), dopo 15 giorni (T15) e alla fine (T30) della prova. Infine, per quanto riguarda l’efficacia e l’attività del prodotto è stata data dai volontari una valutazione soggettiva di efficacia e di tollerabilità attraverso un questionario di valutazione.

Risultati
Influenza sulla sintesi proteica
Il trattamento con Pangenine Lolium a 0,3%, 0,5% e 1,0% è risultato efficace per aumentare la sintesi proteica, rispetto alle cellule non trattate (CTR) a tutti i tempi sperimentali monitorati.
Le differenze sono statisticamente significative tra le concentrazioni di 0,3% e 0,5% rispetto al CTR a 8 ore e tra lo 0,5% e 1,0% rispetto al CTR a 24 ore. L’aumento osservato mostra un andamento dose-dipendente. La differenza tra 8 e 24 ore è statisticamente significativa quando concentrazioni di 0,5% e 1,0% Pangenine Lolium vengono aggiunte al mezzo di coltura (Fig. 2).

Effetto anti-ossidante e modulazione di mediatori infiammatori
Il trattamento delle colture cellulari con Pangenine Lolium è efficace nel proteggere le cellule dal danno ossidativo risultante dall’invecchiamento indotto sperimentalmente (Fig.3). Le differenze di livelli di LPO nel campione CTR+ sono statisticamente significative, passando da 1 a 2 e da 2 a 3 irradiazioni UV. Quando le cellule vengono trattate con 0,3% o 0,5% di Pangenine Lolium, le differenze non sono statisticamente significative.
Il trattamento delle colture cellulari con Pangenine Lolium ha influenzato il rilascio dei modulatori infiammatori durante l’induzione dell’invecchiamento sperimentale: infatti, i loro livelli medi diminuiscono dopo ripetute irradiazioni secondo un andamento dose-dipendente.
I risultati per IL1α sono riportati in Figura 4. Questa tendenza è simile per tutti gli altri mediatori testati, i cui dati non sono stati riportati. Infatti, Pangenine Lolium mostra proprietà modulanti e antiossidanti contro gli eventi ossidativi legati all’invecchiamento e all’inflammaging.

Attivazione mitocondriale
Il trattamento delle colture di fibroblasti con Pangenine Lolium migliora l’attivazione mitocondriale nelle cellule in coltura, evidenziando così un incremento dei mitocondri metabolicamente ed energicamente attivi fino al 22,25% dopo il trattamento di 8 ore, e del 161,05% dopo 24 ore di trattamento (Fig.5). A 24 ore, le differenze tra 0,3% e 1,0% di Pangenine Lolium rispetto al CTR a 24 ore sono statisticamente significative. La differenza tra 0,3% e 1,0% di Pangenine Lolium è statisticamente significativa a 24 ore.

Efficacia anti-aging in vivo
L’analisi strumentale della rugosità della pelle dopo il trattamento con una crema contenente Pangenine Lolium ha dimostrato e confermato l’efficacia del principio attivo rispetto al placebo (Fig.6). La diminuzione è statisticamente significativa a T15 e T30 (rispetto T0) per la pelle trattata con Pangenine Lolium.
La differenza tra T15 e T30 è anch’essa significativo. Nel caso del placebo, il valore della rugosità aumenta: la differenza (rispetto T0) è statisticamente significativa a T15 e non significativo a T30. La differenza tra T15 e T30 è altrettanto non significativa. La differenza tra prodotto attivo e placebo è statisticamente significativa. L’analisi clinica dermatologica effettuata ha mostrato un miglioramento dell’aspetto estetico della pelle in termini di rughe (+50 % a T15 e +75 % a T30), di luminosità della pelle (+35 % a T15 e +45 % a T30) e di levigatezza (+55 % a T15 e +70 % a T30). Nessun soggetto ha avuto reazioni avverse.
Le risposte al questionario di auto-valutazione portano a concludere che Pangenine Lolium è stato percepito, in media, come efficace nel rendere la pelle più morbida, luminosa, protetta, elastica e meno ruvida.

Conclusioni
I parametri chiave indicatori di invecchiamento cutaneo in vitro, come l’alterata sintesi proteica, il ridotto effetto anti-ossidante, la maggiore modulazione dei mediatori infiammatori e l’attivazione dei mitocondri, sono migliorati quando i fibroblasti sono stati trattati con Pangenine Lolium. Questo nuovo estratto senza solventi risulta essere un sicuro, efficiente ed efficace ingrediente green adatto per le applicazioni anti-invecchiamento. Infatti, Pangenine Lolium ha indotto significativi miglioramenti nella rugosità della pelle quando viene utilizzato allo 0,5 % in una formulazione cosmetica. La luminosità, le rughe e la morbidezza della pelle sono anche percettivamente migliorate.

Bibliografia
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7 Nichols J.A., Katiyar S.K. – Skin photoprotection by natural polyphenols: Anti-inflammatory, anti-oxidant and DNA repair mechanisms. Arch Dermatol Res. 2010, 302(2):71
8 Yau-Huei Wei, Shi-Bei Wu, Yi-Shing Ma, Hsin-Chen Lee – Respiratory Function Decline and DNA Mutation in Mitochondria, Oxidative Stress and Altered Gene Expression during Aging. Chang Gung Med J 2009, 32(2):113-131
9 Salminen Antero, Kai Kaarniranta, Anu Kauppinen – Inflammaging: disturbed interplay between autophagy and inflammasomes. Aging 2012, 4(3):166-175
10 Principium Internal Documentation about Pangenine® Lolium, accessed on april 2013
11 In Vitro Efficacy Study – Evaluation of the Protein Synthesis Modulation in Cell Culture by an Active for Cosmetic Use. Report TV.01.C_2011/749, Farcoderm France 2011, accessed on april 2013
12 In Vitro Efficacy Study – Evaluation of the Modulation of Some Inflammatory Markers by a Cosmetic Raw Material. Report TV.01.C_2011/747, Farcoderm France 2011, accessed on april 2013
13 In Vitro Efficacy Study – Evaluation of the Mitochondrial Activation After a Treatment with a Cosmetic Raw Material. Report TV.01.C_2011/748, Farcoderm France 2011, accessed on april 2013
14 Clinical-Instrumental Placebo Controlled In Vivo Evaluation of the Anti-Ageing Efficacy of a Raw Material for Cosmetic Use. Report FU.04.C.L_2011/1060, Farcoderm France 2011, accessed on april 2013